본 발명은 신규한 Cas9 단백질 변이체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 종래 Cas9 단백질에 비해 표적 특이성이 향상된 Cas9 단백질 변이체, 이를 포함하는 CRISPR/Cas9 시스템, 및 이의 유전자 편집 용도에 관한 것이다. 본 발명에서는 Cas9 단백질의 REC2 도메인의 특정 위치에서 아미노산을 치환하는 조작을 통해 checkpoint 구조에서의 비표적 검문을 강화하여 Cas9의 표적 특이성을 향상시켰다. 나아가 REC2 도메인을 조작한 돌연변이와 종래 알려진 Cas9-HF1 또는 eCas9 내 돌연변이의 조합을 통하여 기존에 보고된 Cas9 변이체 종들에 비하여 현저히 우수한 표적 특이성과 표적 서열의 절단 활성을 모두 갖춘 Cas9 단백질 변이체를 개발하였다. 이에, 본 발명은 Cas9 엔지니어링의 유망한 표적으로서 REC2 도메인을 새롭게 제시하였으며, 본 발명을 통해 제조된 Cas9 유전자가위는 유전자 교정 또는 조작이 요구되는 여러 분야, 예컨대 유전 질환, 대사이상 질환, 자가면역 질환, 감염증 등의 치료를 위한 치료제, 농작물의 품종 개량 및 동물의 형질 개량 등의 관련 분야에서 유용하게 활용될 수 있을 것이다.