본 발명은 기존의 티로실-tRNA 합성효소(tyrosyl-tRNA synthetase)보다 앰버 서프레션 활성과 비천연 아미노산 4-아지도-L-페닐알라닌(4-azido-L-phenylalanine) 결합능이 향상된 신규 돌연변이 티로실-tRNA 합성효소 돌연변이체들, 및 이를 이용하여 단백질의 특이 위치에 4-아지도-L-페닐알라닌이 결합된 재조합 단백질을 대장균에서 발현하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 얻어진 돌연변이체들은 단일 복제수(copy)를 가지고 클로닝되어도 기존 돌연변이체의 2 복제수 대비 높은 수율로 앰버 코든(amber codon)의 위치에 4-아지도-L-페닐알라닌을 결합하여 단백질의 합성에 이용할 수 있다.